低血糖的诊断与鉴别需通过多种检查及结合病史。毛细血管血糖测定是诊断重要依据，不同人群低血糖血糖值判断标准不同；血浆胰岛素和C肽测定可助判低血糖原因；饥饿试验可辅助诊断胰岛素瘤但有风险；胰高血糖素刺激试验可用于判断糖原累积症等；腹部影像学检查用于筛查胰腺病变；还需根据病史判断药物性、肝源性、内分泌疾病导致的低血糖。
血浆胰岛素和C肽测定
胰岛素测定：检测血浆胰岛素水平有助于判断低血糖的原因。如果胰岛素水平升高，可能提示胰岛素瘤等疾病导致的低血糖。正常情况下，血浆胰岛素浓度低于24pmol/L（3μU/ml），但在胰岛素瘤患者中，血浆胰岛素可显著升高，有时甚至超过100pmol/L（12μU/ml）。
C肽测定：C肽与胰岛素以等分子数从胰岛β细胞生成及释放，测定C肽可以排除外源性胰岛素干扰。C肽升高常见于胰岛素瘤等导致内源性胰岛素分泌增多的情况。
饥饿试验
让患者在空腹状态下持续饥饿12-72小时，密切监测血糖、胰岛素、C肽等指标。如果在饥饿过程中出现低血糖症状，同时伴有胰岛素水平升高，则支持胰岛素瘤的诊断。但该试验有一定风险，需在严密监护下进行，尤其是对于有严重低血糖风险的患者，如糖尿病患者在进行饥饿试验时要注意防止出现严重低血糖事件。对于儿童患者，由于其身体储备能力相对较弱，进行饥饿试验时更需谨慎，密切观察患儿反应，一旦出现低血糖相关症状应立即终止试验并采取相应措施。
胰高血糖素刺激试验
静脉注射胰高血糖素后，观察血糖变化。正常情况下注射胰高血糖素后血糖应升高，如果血糖不升高或升高不明显，可能提示存在糖原累积症等导致的低血糖情况。对于不同年龄的患者，该试验反应可能有所差异，儿童患者在进行此试验时要根据其年龄调整剂量等相关操作，确保试验安全有效。
腹部影像学检查（如超声、CT或MRI）
超声检查：对于怀疑胰岛素瘤的患者，腹部超声可用于初步筛查胰腺是否有占位性病变。超声检查方便无创，但对于较小的胰腺肿瘤可能存在漏诊的情况。
CT检查：能更清晰地显示胰腺等腹部器官的结构，有助于发现胰腺肿瘤等病变。对于胰腺胰岛素瘤的定位诊断有一定价值，但也存在一定局限性如对于非常小或异位胰腺肿瘤可能难以发现。
MRI检查在诊断胰腺胰岛素瘤方面有较高分辨率尤其对于小的肿瘤或异位肿瘤的检测可能优于CT检查，对于儿童患者，MRI检查相对CT来说辐射剂量更低，更适合长期或多次检查随访等情况，但费用相对较高。
根据病史等综合判断其他原因导致的低血糖
药物性低血糖如果患者有服用降糖药物（如胰岛素、磺脲类降糖药等）或其他可能导致低血糖药物的病史，要考虑药物性低血糖可能结合用药时间、剂量等因素综合分析。对于老年患者，由于其肝肾功能可能减退，药物代谢能力下降，更容易发生药物性低血糖需特别关注其用药史及血糖监测变化；对于儿童患者，如果有使用某些可能影响血糖药物的情况，如一些用于治疗某些疾病的特殊药物也需考虑药物对血糖的影响，在检测低血糖时要结合用药史进行综合判断。
肝源性低血糖有肝脏疾病史的患者，如肝硬化等可导致肝糖原储存和代谢异常，引起低血糖。需要结合肝功能检查、肝脏影像学等检查综合判断肝脏功能状态以及是否存在导致低血糖的肝脏病变。对于患有肝脏疾病的不同年龄患者，如儿童先天性肝病患者，其肝脏代谢功能异常导致低血糖的机制不同需具体分析病情进行相关检查。
内分泌疾病导致的低血糖如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退等内分泌疾病可影响激素分泌，导致血糖调节异常引起低血糖。需要结合相应内分泌激素的测定等检查明确内分泌疾病诊断进而判断是否由其导致低血糖。对于不同性别患者内分泌疾病导致低血糖可能有不同特点如女性患者内分泌波动较大等情况也需考虑在内。
