免疫组织化学需进行样本处理、抗原修复、封闭、一抗二抗孵育及显色观察，免疫印迹包括蛋白提取定量、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育与显色，酶联免疫吸附有包被抗原抗体、封闭、加样、孵育二抗、加底物及读数，儿童样本采集要安抚情绪轻柔操作防溶血，老年人样本处理注意穿刺技巧、组织弹性及生物安全防护。
一、免疫组织化学实验步骤及要点
1.样本处理：根据样本类型（如组织、细胞）进行固定，选用合适固定液（如甲醛固定液），组织样本固定时间一般12~24小时，确保抗原保存完好，后续进行包埋、切片操作。
2.抗原修复：针对甲醛固定样本常需抗原修复，热修复可采用高压蒸汽或微波处理，高压蒸汽修复一般98~100℃处理10~15分钟，使抗原表位暴露。
3.封闭：使用牛血清白蛋白等封闭液封闭非特异性位点，室温孵育30~60分钟。
4.一抗孵育：依据实验目的选合适一抗，稀释后4℃孵育过夜或37℃孵育1~2小时。
5.二抗孵育：选对应一抗的二抗，稀释后孵育，时间和温度同一抗孵育。
6.显色观察：用DAB等显色剂显色，根据染色情况调整显色时间，于显微镜下观察结果。
二、免疫印迹实验步骤及要点
1.蛋白提取：依样本类型用RIPA等裂解液冰上提取蛋白，提取时间约30分钟，保证蛋白活性。
2.蛋白定量：采用BCA法等准确测量蛋白浓度，使后续上样量一致。
3.SDS-PAGE电泳：按蛋白分子量选合适浓度凝胶，依蛋白定量结果确定上样量，控制电压和时间使蛋白分离良好。
4.转膜：将电泳分离蛋白转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜，恒流转膜1~2小时，保证转膜效果。
5.封闭：用5%脱脂牛奶或BSA封闭膜上非特异性位点，室温摇床孵育1~2小时。
6.一抗二抗孵育：同免疫组织化学实验，一抗孵育后用TBST多次洗涤，再孵育二抗并洗涤。
7.显色：用化学发光试剂显色，通过显影胶片或化学发光成像系统观察结果。
三、酶联免疫吸附实验步骤及要点
1.包被抗原或抗体：将抗原或抗体包被酶标板孔，4℃孵育过夜或37℃孵育2小时，确保包被完全。
2.封闭：加入封闭液37℃孵育1小时，封闭孔内剩余位点。
3.加样：加入待检样本、标准品等，37℃孵育30~60分钟，使样本中抗体或抗原与包被物结合。
4.孵育：加酶标二抗后37℃孵育30~60分钟。
5.加酶标底物：加入显色底物避光孵育15~30分钟，显色反应与样本中目标物质含量相关。
6.读数：用酶标仪在特定波长读取吸光度值，依标准曲线计算样本中目标物质浓度。
四、实验中的特殊人群注意事项
1.儿童样本采集：需安抚儿童情绪，避免哭闹致样本采集困难或溶血影响结果，血液样本采集时轻柔操作。
2.老年人样本处理：老年人血液循环可能较慢，血液样本采集注意穿刺技巧，避免多次穿刺；组织样本采集考虑其组织弹性，操作谨慎以防样本受损，同时严格遵循实验室生物安全规范，做好防护避免交叉污染。
