青霉素类与头孢类药物在化学结构、抗菌谱、耐药性、不良反应等方面存在差异，青霉素基本结构是6-氨基青霉烷酸，头孢类是7-氨基头孢烷酸；青霉素对革兰阳性菌等作用较强但对革兰阴性杆菌弱，头孢类抗菌谱更广；青霉素耐药普遍因产青霉素酶，头孢类不同代耐药情况有别；两者都可致过敏反应，青霉素过敏率高，头孢过敏率稍低，第一代头孢有肾毒性，三代肾毒性低，妊娠期和儿童使用需分别注意相关情况。
抗菌谱方面
青霉素对大多数革兰阳性菌（如溶血性链球菌、肺炎链球菌等）、部分革兰阴性球菌（如脑膜炎奈瑟菌等）有较强抗菌活性，对螺旋体（如梅毒螺旋体）也有良好作用，但对大多数革兰阴性杆菌作用较弱。头孢类药物抗菌谱较青霉素广，第一代头孢菌素对革兰阳性菌的抗菌活性较强，对部分革兰阴性菌也有一定作用；第二代头孢菌素对革兰阳性菌活性与第一代相近或稍弱，对革兰阴性菌的抗菌谱有所扩大，对部分厌氧菌有效；第三代头孢菌素对革兰阴性菌的抗菌活性更强，抗菌谱更广，对铜绿假单胞菌等有一定作用；第四代头孢菌素对革兰阳性菌、阴性菌的抗菌活性都较强，对β-内酰胺酶更稳定。
耐药性方面
由于细菌的进化和广泛使用，青霉素类药物的耐药情况较为普遍，很多革兰阳性菌和部分革兰阴性菌可产生青霉素酶，使青霉素失活从而耐药。而头孢类药物相对来说，不同代别的头孢菌素耐药情况有所差异，随着头孢菌素的不断发展，耐药机制也在不断变化，但总体上头孢菌素在临床应用中仍有较好的抗菌效果，但耐药问题也需关注。
不良反应方面
两者都可能引起过敏反应，但青霉素的过敏反应发生率相对较高，严重过敏反应（如过敏性休克）也较常见。头孢类药物的过敏反应发生率相对青霉素稍低，但也可出现皮疹、药热等过敏表现，严重过敏反应也有发生。在肾毒性方面，第一代头孢菌素可能有一定肾毒性，而第三代头孢菌素肾毒性相对较低，但肾功能不全患者使用时都需要调整剂量。对于特殊人群，如孕妇，青霉素类药物在妊娠期使用相对较安全，属于B类药物；头孢类药物在妊娠期使用需根据具体药物及情况谨慎选择。对于儿童，使用时都要根据体重等计算剂量，且要密切观察不良反应，因为儿童的肝肾功能发育尚未完全成熟，对药物的代谢和排泄能力与成人不同。
