新生儿肛门闭锁的原因包括遗传因素（部分与单基因遗传疾病及特定基因突变致胚胎发育异常相关，遗传模式复杂）、胚胎发育异常（妊娠4-7周泄殖腔分隔障碍致肛门直肠结构异常）、环境因素（孕期感染风疹病毒等、接触化学毒物等有害物质、用药不当影响胚胎发育）以及其他因素（早产、多胎妊娠增加患病风险）。
胚胎发育异常
在胚胎发育的早期阶段（通常是妊娠的第4-7周），泄殖腔的分隔出现障碍是导致肛门闭锁的重要原因。正常情况下，胚胎发育过程中泄殖腔会被逐渐分隔为尿生殖窦和直肠，若分隔过程发生异常，就会使直肠与泌尿生殖系统等结构的连接出现异常，进而引起肛门闭锁。例如，泄殖腔膜未破裂或分隔不完全等情况，都可能干扰正常的肛门直肠发育，最终导致新生儿出生时出现肛门闭锁的畸形。
环境因素
孕期感染：孕妇在孕期如果受到某些病毒感染，如风疹病毒等，可能会影响胚胎的正常发育，增加新生儿出现肛门闭锁等先天性畸形的风险。研究表明，孕期感染风疹病毒后，病毒可以通过胎盘影响胚胎的组织器官发育，干扰泄殖腔分隔等关键发育过程，从而导致肛门直肠发育异常。
孕期接触有害物质：孕妇在孕期接触一些有害物质，如某些化学毒物、放射性物质等，也可能对胚胎发育产生不良影响。例如，长期接触某些有机溶剂等化学物质，可能会干扰胚胎细胞的正常分化和发育，使得肛门直肠的形成过程受到阻碍，进而引发肛门闭锁。
孕期用药不当：孕妇在孕期如果不合理使用某些药物，也可能影响胚胎发育。虽然不是所有药物都会导致肛门闭锁，但一些具有致畸潜能的药物可能会在特定的胚胎发育时期干扰相关组织器官的形成，其中就包括影响肛门直肠的发育，增加新生儿肛门闭锁的发生几率。
其他因素
早产：早产儿发生肛门闭锁的风险相对较高。这是因为早产儿的各器官系统发育尚未完全成熟，在胚胎发育的关键时期可能还没有达到足够的成熟度来完成正常的肛门直肠发育过程，所以早产可能是导致新生儿肛门闭锁的一个相关因素。
多胎妊娠：多胎妊娠时，子宫内的空间相对狭窄，胚胎发育所需的营养物质等供应可能相对不足，同时多个胚胎之间可能会相互影响发育环境，这些因素都可能增加新生儿出现肛门闭锁等先天性畸形的可能性。
