在无菌超净工作台内操作获取新鲜胶质瘤核心区域组织无菌取材，用含双抗PBS冲洗后剪碎组织块多次漂洗，选胰蛋白酶或胶原酶37℃消化并轻柔吹打至组织块松散时终止，胰蛋白酶消化加含血清培养基终止后经滤网过滤得单细胞悬液，将其接种至培养瓶等置于37℃、5%CO?培养箱培养，依细胞状态调整初期2-3天一次的换液频率。
一、取材准备
1.环境要求：在无菌超净工作台内操作，确保环境无菌，避免杂菌污染。对于儿童患者，需格外严格执行无菌流程，因为儿童免疫力相对较低，污染风险对细胞培养影响更显著。
2.组织获取：获取新鲜胶质瘤组织，尽量选取肿瘤核心区域组织，避开坏死部分，使用无菌器械取材，避免交叉污染，不同性别患者取材操作无本质性别差异，但需遵循统一无菌规范。
二、组织处理
1.组织剪碎：将获取的胶质瘤组织用含双抗（青霉素、链霉素）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，剪成约1mm3大小的组织块，此过程需快速操作以减少组织氧化损伤。
2.多次漂洗：用含双抗的PBS反复漂洗剪碎的组织块，至少3次，彻底清除血液等杂质，确保后续消化环境纯净。
三、消化步骤
1.选择消化试剂：可选用0.25%胰蛋白酶或胶原酶进行消化，37℃恒温条件下进行，胰蛋白酶消化时间一般为15~30分钟，胶原酶消化时间可能因组织特性略有不同。对于儿童患者，需谨慎选择消化试剂浓度和时间，避免过度消化损伤细胞。
2.消化操作：将剪碎的组织块加入消化试剂后，可轻柔吹打组织块以促进消化进行，密切观察组织块消化状态，当组织块开始松散时终止消化。
四、单细胞悬液制备
1.终止消化：加入含血清的培养基终止胰蛋白酶消化，对于胶原酶消化可直接进行下一步操作。
2.滤网过滤：将消化后的混合物通过无菌滤网过滤，去除未消化的组织块，得到单细胞悬液，过滤过程需保证滤网无菌，防止引入新的污染。
五、细胞接种与培养
1.接种：将单细胞悬液接种至合适的培养瓶或培养板中，接种密度根据细胞生长特性合理调整，置于37℃、5%CO?的培养箱中培养，培养箱需定期消毒维护以保证稳定的培养环境。
2.培养基更换：培养初期通常2~3天更换一次培养基，观察细胞生长情况，根据细胞状态调整换液频率，不同年龄患者细胞生长速度可能有差异，需密切监测。
