恶性贫血的诊断需通过病史采集、体格检查、实验室检查（包括血常规、血清维生素B、血清叶酸、甲基丙二酸和同型半胱氨酸、内因子抗体检测）、骨髓穿刺检查及对有神经系统症状患者的神经系统相关检查来综合判断，病史采集要问症状、家族史等，体格检查看贫血面容、舌部及神经系统体征，实验室检查可提示大细胞性贫血、维生素B缺乏等，骨髓象有红系巨幼变，不同年龄人群检查有相应特点及参考值差异。
一、病史采集
详细询问患者的症状表现，包括是否有乏力、头晕、心悸等贫血相关表现，以及是否存在舌炎、味觉减退、消化不良等胃肠道症状。同时了解患者的家族史，某些遗传性因素可能与恶性贫血相关。不同年龄、性别患者表现可能有差异，比如老年患者可能因基础疾病掩盖症状，女性可能因月经等失血情况需鉴别贫血原因。
二、体格检查
观察患者有无贫血面容，如面色苍白等。检查舌部情况，恶性贫血患者可能出现舌乳头萎缩、舌面光滑等表现。同时检查神经系统体征，部分恶性贫血患者会有神经系统受累表现，如肢体麻木、行走不稳等。
三、实验室检查
（一）血常规
呈现大细胞性贫血，红细胞平均体积（MCV）增高，红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）正常。不同年龄人群正常参考值有差异，例如成人MCV正常范围约82-100fl，儿童因年龄不同参考值不同，通过血常规可初步提示贫血类型为大细胞性贫血。
（二）血清维生素B测定
血清维生素B水平降低，正常血清维生素B浓度为133-675pmol/L，当低于100pmol/L时高度提示维生素B缺乏。年龄增长可能影响维生素B的代谢等情况，老年人可能因摄入不足、吸收障碍等更易出现维生素B水平降低。
（三）血清叶酸测定
血清叶酸水平一般正常，可用于与其他原因引起的大细胞性贫血鉴别，如巨幼细胞贫血若为叶酸缺乏引起则血清叶酸降低，而恶性贫血主要是维生素B缺乏。
（四）甲基丙二酸和同型半胱氨酸测定
甲基丙二酸和同型半胱氨酸水平升高，因为维生素B缺乏会影响甲基丙二酸代谢及同型半胱氨酸向蛋氨酸的转化，这是维生素B缺乏的敏感指标，不同年龄患者此指标变化的病理意义相同。
（五）内因子抗体检测
存在壁细胞抗体和内因子抗体，其中内因子抗体分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅱ型内因子抗体具有诊断价值，它可阻断维生素B-内因子复合物与回肠受体结合，导致维生素B吸收障碍。
四、骨髓穿刺检查
骨髓象显示增生活跃，红系增生明显，出现巨幼变，表现为幼红细胞体积增大、核染色质疏松等。不同年龄患者骨髓象表现基本一致，但幼儿等特殊人群骨髓造血功能特点可能影响对巨幼变的观察和判断。
五、其他检查
对于有神经系统症状的患者，可能需要进行神经系统相关检查，如神经传导速度等，以评估神经系统受累程度，不同年龄患者神经系统检查的侧重点和正常参考值不同，例如儿童神经系统发育未成熟，检查结果解读需考虑年龄因素。
