硬下疳的诊断需从病史采集、临床表现观察、实验室检查及鉴别诊断等方面进行。病史采集要询问性接触史和潜伏期；临床表现观察其好发部位及典型形态；实验室检查包括暗视野显微镜检查找梅毒螺旋体、血清学检查的非梅毒螺旋体抗原血清学试验和梅毒螺旋体抗原血清学试验；鉴别诊断需与软下疳、生殖器疱疹、固定型药疹等区分，孕妇和儿童感染梅毒时硬下疳表现有特殊情况。
潜伏期：了解从可能感染梅毒到出现硬下疳症状的时间，梅毒硬下疳的潜伏期一般为9~90天，平均21天。不同个体因身体状况、感染梅毒螺旋体的数量等因素，潜伏期会有所差异。
临床表现观察
部位：硬下疳通常发生在外生殖器部位，男性多见于阴茎冠状沟、龟头、包皮及系带；女性多见于大小阴唇、阴唇系带、会阴及宫颈等。少数情况下也可发生在肛门、直肠、口唇、乳房等部位。这是因为这些部位是性接触时的主要接触区域，容易受到梅毒螺旋体的侵袭。
形态：初起为单个暗红色斑疹或丘疹，迅速变为无痛性炎性硬结，境界清楚，周围绕以红晕，直径1~2cm，表面呈糜烂或浅溃疡，溃疡面清洁，渗出物少，触之有软骨样硬度。这种典型的形态是硬下疳的重要特征之一，由于其硬度如软骨，与其他一般的炎症性皮损有明显区别。
实验室检查
暗视野显微镜检查：取硬下疳处的渗出物或组织液，在暗视野显微镜下观察，可直接看到运动活泼的梅毒螺旋体。这是一种直接检测病原体的方法，特异性较高，如果在镜下观察到典型的梅毒螺旋体形态，对硬下疳的诊断有重要意义。但该检查需要一定的设备和技术，且阳性率会受到取材部位、标本采集时间等因素影响，比如取材部位不当或标本采集后放置时间过长等，可能会导致假阴性结果。
血清学检查
非梅毒螺旋体抗原血清学试验：常用的有快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）和甲苯胺红不加热血清学试验（TRUST）等。这类试验是用心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原，检测患者血清中的反应素（抗心磷脂抗体）。在硬下疳初期，部分患者可能出现阳性结果，但早期可能存在假阴性情况。一般在硬下疳发生1~2周后，血清学试验逐渐转为阳性，其滴度与疾病的活动程度相关。例如，在一期梅毒硬下疳时，RPR或TRUST的阳性率约为50%~70%，随着病情进展，阳性率会逐渐升高。
梅毒螺旋体抗原血清学试验：常用的有梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）等。这类试验特异性较高，即使患者经过治疗，血清学反应仍可能长期甚至终身阳性。在硬下疳时期，该类试验也会逐渐转为阳性，可用于确诊梅毒。例如，TPPA试验的敏感性和特异性都较高，在硬下疳诊断中具有重要价值，但该试验不能区分梅毒的病程是既往感染还是现症感染。
鉴别诊断
软下疳：由杜克雷嗜血杆菌引起，潜伏期较短，一般为2~5天。损害多为多发性、疼痛明显的溃疡，基底柔软，有脓性分泌物，涂片可查到杜克雷嗜血杆菌。而硬下疳通常为单个、无痛性溃疡，基底硬。
生殖器疱疹：由单纯疱疹病毒引起，表现为簇集或散在的小水疱，破溃后形成浅溃疡，有疼痛，病程有自限性，但易复发。通过病毒学检查可发现单纯疱疹病毒。与硬下疳的形态、病原体等方面有明显区别。
固定型药疹：有服药史，皮损为圆形或椭圆形水肿性红斑，境界清楚，重者中央形成水疱或大疱，愈后留有色素沉着。一般有明确的用药诱因，与梅毒硬下疳的病因、临床表现等不同。
特殊人群方面，孕妇感染梅毒时，硬下疳的表现可能不典型，需要更加细致地进行病史采集和检查，因为梅毒可通过胎盘传给胎儿，导致先天梅毒，所以对于孕妇要特别注意梅毒的筛查和诊断，以便及时采取措施防止先天梅毒的发生。儿童感染梅毒多为先天梅毒，后天感染梅毒相对少见，儿童感染梅毒时硬下疳的表现也可能与成人有所不同，需要结合儿童的具体情况，如母亲的梅毒感染情况等进行综合判断和检查。
