支原体感染需结合感染部位与临床症状选择检查方法，常用核酸检测、培养、血清学检测及分泌物镜检，必要时辅以影像学评估。
核酸检测（PCR法）
取咽拭子、痰液、尿道/宫颈分泌物等样本，通过实时荧光定量PCR直接扩增支原体特异性核酸片段，敏感性达95%以上，特异性超98%，适用于早期感染（发病3天内）快速诊断及病原体确认，尤其适合婴幼儿、孕妇等特殊人群的无创样本采集（如孕妇宫颈采样前需消毒）。
培养法
采集泌尿生殖道分泌物（需避免污染）或呼吸道样本，接种于含10%马血清的支原体专用培养基，37℃微需氧环境培养3-7天，是明确病原体的金标准，可区分肺炎支原体与泌尿生殖道支原体，但耗时且成本较高，需严格无菌操作（如排除污染菌干扰）。
血清学抗体检测
检测血清中肺炎支原体IgM、IgG抗体，IgM阳性提示感染后1周内急性感染（特异性约85%），IgG恢复期较急性期（间隔2-4周）呈四倍以上升高提示近期感染，适用于流行病学调查或回顾性诊断，但IgM在感染早期（<1周）可能阴性，需结合临床动态观察抗体变化。
分泌物镜检
取尿道/宫颈分泌物涂片，革兰染色或吉姆萨染色后镜检，可见直径0.3-0.5μm的多形性微生物，但敏感性仅50%-60%，仅作为初步筛查手段，需结合核酸检测或培养确诊，尤其对免疫低下者易漏检。
影像学检查
肺炎支原体感染时行胸部CT或胸片检查，典型表现为间质性肺炎（网格状阴影）、支气管肺炎（沿支气管分布的斑片状阴影），可排除细菌性肺炎（如大叶性实变），但需与流感病毒等其他病原体感染鉴别，必要时结合核酸检测定位感染部位。
特殊人群注意事项
婴幼儿（2岁以下）优先采用核酸检测（咽拭子），避免分泌物镜检刺激呼吸道；孕妇宫颈采样需轻柔并排空膀胱；免疫力低下者（如HIV感染者）培养法假阴性率高，建议以核酸检测为主；慢性肾病患者IgG水平可能因肾功能下降升高，需结合临床综合判断。
