肾上腺脑白质营养不良可根据临床症状、实验室检查及影像学检查进行诊断，儿童患者多5-14岁发病，有学习能力下降等表现，成年患者有进行性认知功能减退等表现；血液生化检查可见血浆极长链脂肪酸尤其是二十六烷酸及其与二十四烷酸比值升高，合并肾上腺皮质功能减退时血皮质醇等有相应改变，基因检测可发现ABCD1基因突变；头颅MRI儿童早期双侧顶枕叶白质对称性T2加权像高信号等，成年有脑室周围白质异常信号等。
成年患者：成年发病者症状相对较晚出现，可能有进行性的认知功能减退、步态不稳、性功能障碍等表现，部分患者会出现肾上腺皮质功能减退的症状，如皮肤色素沉着、乏力、体重减轻等。
实验室检查
血液生化检查：
极长链脂肪酸（VLCFA）测定：血浆中极长链脂肪酸尤其是二十六烷酸（C26：0）及其与二十四烷酸（C24：0）的比值（C26：0/C24：0）升高是肾上腺脑白质营养不良的重要生化指标。正常情况下，血浆中C26：0浓度低于0.2mmol/L，C24：0浓度在0.1-0.3mmol/L之间，C26：0/C24：0比值通常小于0.2。而患者血浆中C26：0明显升高，C26：0/C24：0比值可显著高于正常，一般大于0.2。
肾上腺皮质功能相关指标：若合并肾上腺皮质功能减退，可能出现血皮质醇降低、促肾上腺皮质激素（ACTH）升高的情况。
基因检测：通过对ABCD1基因进行检测，可发现该基因的突变，这是诊断肾上腺脑白质营养不良的金标准。ABCD1基因位于X染色体上，基因检测可以发现多种类型的突变，如错义突变、无义突变、缺失突变等。例如，特定的基因位点突变与肾上腺脑白质营养不良的发病密切相关，通过对患者外周血或其他组织细胞中的DNA进行检测，能够明确是否存在相关基因突变。
影像学检查
头颅磁共振成像（MRI）：
儿童患者：早期MRI表现为双侧顶枕叶白质对称性T2加权像高信号，病灶可呈蝶翼状分布，随着病情进展，病灶会逐渐累及额叶、颞叶等区域，病变可伴有强化。例如，在疾病早期，MRI上可见顶枕叶白质区域信号改变，随着时间推移，病变范围扩大且信号特征有相应变化。
成年患者：MRI表现与儿童有所不同，可能表现为脑室周围白质的异常信号，病变分布相对较散在，但也具有一定的对称性特点，可通过MRI观察白质病变的范围、程度等情况，对疾病的诊断和病情评估有重要价值。
