恶性贫血需从临床表现评估、实验室检查、胃镜及胃黏膜活检进行诊断。临床表现有贫血相关表现、舌炎、神经系统症状等；实验室检查包括血常规呈大细胞性贫血等，血清维生素B测定低于100pg/ml可辅助诊断，血清甲基丙二酸和同型半胱氨酸测定可反映维生素B代谢异常，内因子抗体检测中IFA有诊断特异性，骨髓穿刺见增生活跃等；胃镜及胃黏膜活检可观察胃黏膜及发现病理改变助诊。
一、临床表现评估
恶性贫血患者常出现乏力、疲倦、头晕等贫血相关表现，还可能有舌炎（舌面光滑、疼痛等）、神经系统症状（如肢体麻木、步态不稳等），不同年龄、性别患者表现可能因个体差异有一定不同，比如儿童可能在生长发育方面受影响，女性可能因贫血加重月经异常等情况，有相关病史者要注意既往是否有胃肠道疾病等可能影响维生素B吸收的情况。
二、实验室检查
血常规：呈大细胞性贫血，红细胞平均体积（MCV）增大，红细胞计数、血红蛋白浓度降低，网织红细胞计数正常或轻度增高。不同年龄人群正常血常规指标范围不同，比如儿童的血常规正常范围与成人有差异，需依据对应年龄段参考值判断。
血清维生素B测定：血清维生素B浓度低于100pg/ml（正常范围约200-900pg/ml）可诊断维生素B缺乏，但需结合临床，因为部分老年人等可能血清维生素B处于低限但无临床表现，而恶性贫血患者多明显降低。
血清甲基丙二酸（MMA）和同型半胱氨酸测定：维生素B缺乏时，MMA和同型半胱氨酸水平升高，这是维生素B缺乏较敏感的指标，能更早发现维生素B代谢异常情况。
内因子抗体检测：存在两种内因子抗体，即壁细胞抗体（PCA）和内因子抗体（IFA），其中IFA具有诊断特异性，恶性贫血患者中IFA阳性率较高，约60%-90%，IFA又分为阻断型和结合型，对诊断恶性贫血有重要意义。
骨髓穿刺检查：骨髓象呈增生活跃，红系增生显著，巨幼红细胞常大于10%，粒细胞和巨核细胞也可有巨幼变，通过骨髓象检查可辅助诊断巨幼细胞贫血相关情况，进而帮助考虑恶性贫血可能。
三、胃镜及胃黏膜活检
胃镜检查可观察胃黏膜情况，恶性贫血患者常存在胃黏膜萎缩等改变，胃黏膜活检可发现壁细胞抗体相关的病理改变等，有助于明确是否存在因胃内因子分泌障碍导致维生素B吸收不良的情况，不同年龄患者胃镜操作需注意的细节不同，比如儿童胃镜检查要严格把握适应证和操作规范等。
