女性常规检查时机建议在月经周期第2-4天（卵泡期）空腹进行，此时雌激素、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）等处于基础水平，能准确反映卵巢功能状态，避免周期中激素波动干扰结果。月经周期第2-4天内，孕激素水平低，可排除黄体期对基础激素的影响，适合评估基础内分泌状态。
月经周期不规律或闭经者无需等待周期，可随时空腹检查，以明确内分泌基础状态。若月经长期不来潮，检查结果异常（如LH/FSH比值＞2）需结合临床排查多囊卵巢综合征等疾病。
黄体功能不全筛查建议在月经周期第21-23天（黄体中期）检查孕酮，若孕酮＜5ng/ml提示黄体功能不足，可能影响妊娠维持。
男性无严格周期但宜早晨8-11点空腹检查，此时泌乳素分泌相对稳定，避免下午因皮质醇等应激激素升高干扰结果。若怀疑睾酮水平异常，需连续2-3天复查，排除单次波动影响。
围绝经期女性（45岁以上）若月经周期紊乱、潮热盗汗等症状出现，可任意时间检查，重点关注FSH（＞25U/L提示卵巢功能减退）和雌二醇（＜20pg/ml提示绝经期），FSH＞40U/L提示卵巢功能衰竭。青春期女性（月经初潮后1年仍未规律）或性早熟（女孩＜8岁乳房发育）需在就诊时直接检查，同步评估骨龄，避免误诊。
检查前24小时内避免剧烈运动、情绪激动，保持规律作息，检查前4小时内禁食，前一天晚8点后禁食水，减少泌乳素和皮质醇波动影响。14岁以下儿童除非明确发育异常（如性早熟），否则不建议常规检查；孕期女性除非有异常出血或流产史，否则无需检查性激素六项。
