青霉素可用于治疗革兰阳性球菌感染（如溶血性链球菌引发的相关病症、肺炎链球菌导致的病症等）、革兰阳性杆菌感染（白喉杆菌感染需配合白喉抗毒素使用）、螺旋体感染（梅毒、钩端螺旋体病）、革兰阴性球菌感染（脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓膜炎）、放线菌病（首选药物），儿童用需依病情合理用药因肝肾功能不完善留意影响，孕妇用需医生充分评估利弊考量对胎儿潜在影响，有青霉素过敏史者绝对禁忌以防出现严重过敏反应如过敏性休克等。
青霉素主要用于治疗以下几类细菌感染性疾病：一、革兰阳性球菌感染，例如溶血性链球菌引发的咽炎、扁桃体炎、猩红热、蜂窝织炎等，以及肺炎链球菌导致的肺炎、中耳炎等，青霉素对这类革兰阳性球菌感染具有较好的抗菌活性；二、革兰阳性杆菌感染，像白喉杆菌感染时，需配合白喉抗毒素使用青霉素进行治疗；三、螺旋体感染，梅毒螺旋体引起的梅毒，以及钩端螺旋体病均可用青霉素治疗；四、革兰阴性球菌感染，脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓膜炎可选用青霉素；五、放线菌病，青霉素是治疗放线菌病的首选药物。特殊人群方面，儿童使用青霉素需严格依据病情合理用药，因儿童肝肾功能发育尚不完善，要密切留意药物可能带来的影响；孕妇使用青霉素需由医生充分评估利弊后谨慎决定，需考量药物对胎儿的潜在影响；有青霉素过敏史者绝对禁忌使用青霉素，以防出现严重过敏反应，如过敏性休克等危及生命的情况。
